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上周我们一起讨论了基于Venor®Gem qEP试剂盒的支原体qPCR经典检测法，也是目前使用比较广泛的方法之一。
当然啦，关于支原体的检测，方法众多。今天我们就来了解一下，操作相对更简单的“一步法”。该方法会用到Minerva Biolabs公司的另一种试剂盒——VenorGeM® OneStep，它与上周介绍的经典法试剂盒类似，都是利用了荧光定量PCR的基本原理。
不同的是，“一步法”试剂盒中，直接将内控添加到预混液中，使用起来更加方便、节省时间。
下面我们就来详细介绍一下VenorGeM® OneStep支原体检测试剂盒。
使用方法步骤
与经典法大致相同：
样品处理➡试剂制备➡体系建立➡启动PCR反应➡结果判定
样品处理：
取100μl左右的细胞上清液
95℃孵育后离心，取适量用于后续qPCR。
细胞培养样品易含丰富的DNA酶，在低温下也能降解支原体DNA。因而推荐进行样品稳定化处理。
试剂制备：
将缓冲液、预混液、阳性对照等试剂按照说明书要求，该离心的离心、该混合的混合，处理好后扣紧盖子备用。
PCR体系建立：
在PCR管中，根据需要，加入样品、阳性对照、新鲜培养基（阴性对照），并且设置好重复孔，盖好盖子，震荡混匀。
启动PCR反应：
按照所需参数，设置好PCR仪，启动程序。
FAM通道：检测支原体荧光信号。
HEX通道：检测内控对照荧光信号
支原体DNA和内控DNA，存在信号之间的竞争性抑制
支原体DNA越多，FAM通道信号越高
检测内控对照的HEX信号通道信号越低。
定量需要基于Ct值和DNA标准曲线
Ct＜40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。
小结：
总的来说，一步法试剂盒是经典版试剂盒的升级版。
在以下几个方面都是相同的：
①都具有高特异性：一次即可涵盖所有常见易感染细胞的支原体物种（包括欧洲药典规定的9种支原体）。与细菌和真核DNA无交叉反应。
②都具有高灵敏度：最高检测限可达到10CFU/ml。
③都具有相应配套的支原体基因组DNA和细菌基因组DNA，便于特异性验证。
④都有相应配套的支原体绝对定量标准品，便于最后定量检测。
不同之处在于，一步法试剂盒省去了配置内控对照的环节，为实验人员节省了宝贵时间，但相应的，价格也会比经典法试剂盒高出一部分。
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